本发明公开了利用RNAi技术控制所述的水稻育性基因的表达获得水稻不育系的方法，包括扩增用于产生反义RNA的DNA片段，然后构建表达载体，再将该DNA片段转化正常可育水稻，可得新的水稻核不育材料。本发明提供的产生核不育系的方法简便，快速；利用本发明方法获得的核不育材料可用于在水稻杂交时取代人工去雄，节约劳力；或用于轮回选择育种，对扩大水稻的种质基础有重要作用。
1.利用RNAi技术控制如SEQxa0IDxa0NO:1xa0所示序列的水稻育性基因的表达获得水稻不育系的方法，包括如下步骤：（1）以正常可育的水稻品种的cDNA为模板，以ASABCG15-F和ASABCG15-R为引物进行PCR扩增，获得493bp的PCR扩增产物，命名为ASABCG15；所述的引物为由SEQxa0IDxa0No:4和SEQxa0IDxa0No:5所示的核苷酸序列；所述的PCR反应体系为：cDNAxa03μL，dNTPxa05μL，10XPCRxa0缓冲液xa05μL，25mMxa0Mg²⁺xa02μL，引物10μMxa01.5μL；KOD-plus-NEOxa0酶xa01.5μL；DMSOxa01.5μL；H₂Oxa030.5μL；所述的PCR的反应条件：94℃xa02min；98℃xa010s，68℃xa030s，35个循环；72℃10min，10℃xa01min；所述的ASABCG15由SEQxa0IDxa0No:16所示的核苷酸序列组成；（2）回收PCR扩增产物，并将PCR扩增产物与载体PMD20连接，得连接产物；将连接产物转化至宿主细胞，37℃过夜培养；然后挑取单菌至LB液体培养基过夜培养；提取质粒，然后检测阳性质粒，并对质粒中的插入序列进行测序，确认插入序列为ASABCG15序列，得到PMD20-ASABCG15载体；将PMD20-ASABCG15载体和pOsAct2-nos载体同时用KpnⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，将酶切产物回收，连接、转化，构建成pOsAct2-ASABCG15载体；将pOsAct2-ASABCG15xa0载体通过农杆菌转化到EHA105菌株，转化后所得菌株命名为EHA105-pOsAct2-ASABCG15；（3）培育水稻愈伤组织，将EHA105-pOsAct2-ASABCG15通过农杆菌介导转化的方法转化进水稻愈伤组织中，然后利用潮霉素基因对转基因苗进行阳性检测，并且对ABCG15的RNA表达量进行检测，选择表现完全雄性不育、且检测不到ABCG15表达量的植株，即为通过RNAi技术得到的水稻雄性核不育材料。
2.用于扩增生产如SEQxa0IDxa0No:16所示的利用RNA技术控制如SEQxa0IDxa0No:1所示序列的水稻育性基因的反义RNA的DNA片段的PCR引物，其特征在于所述的引物由SEQxa0IDxa0No:4和SEQxa0IDxa0No:5所示的核苷酸序列组成。
3.用于产生利用RNAi技术控制如SEQxa0IDxa0No:1所示序列的水稻育性基因的反义RNA的DNA片段，其特征在于所述的DNA片段由SEQxa0IDxa0No:16所示的核苷酸序列组成。本申请是2012年3月7日提出的发明专利申请“控制水稻育性的基因及其编码蛋白和应用”（申请号为：201210057952.8）的分案申请。技术领域
本发明属于植物育性基因领域。具体涉及用RNAi技术控制水稻育性基因获得水稻不育系的方法
背景技术
水稻是自花授粉作物，长期以来水稻品种的改良主要依赖杂交育种方法，但是由于人工去雄和杂交技术的限制，通常只能利用少数亲本进行杂交，亲本来源范围窄，导致品种遗传基础日渐狭窄，难以育成突破性的品种。水稻的主要农艺性状多为微效多基因控制的数量性状，轮回选择育种方法可以打破不利基因的连锁，增加优良基因的积累，因而是扩大遗传基础，育成突破性品种的重要手段，但是由于人工去雄困难等限制，使轮回选择育种方法在自花授粉作物上的应用受到限制。xa0而核不育基因的发现为自花授粉作物应用轮回选择育种方法提供了可能。Gilmore提出将核不育材料应用于自花授粉作物的轮回选择（Gilmore,xa0E.C,xa0Jr.xa0Cropxa0Sci,xa01964.4:323-325）。Fujimaki提出将核不育材料用于水稻的轮回选择（Fujimaki.xa0H,xa0S等.xa0Japan.xa0J.xa0Breed.xa01977.xa027:xa070-77）。Lkehashi详细描述了将核不育用于水稻于轮回选择的方法(Lkehashiu3000H．Japan．J．Breed,1980,31:205-209)。利用现有的水稻隐性雄性核不育进行水稻轮回选择育种存在的主要问题是：（1）群体的总体性状受隐性核不育基因供体材料遗传背景的影响大，容易导致群体的遗传类型和性状表现单一，难以育成优良品系；（2）带有隐性核不育基因株系的选择或剔除是依据后代的自然分离进行，费时且工作量大，效率低。因此，需要寻找新的用于水稻轮回选择的隐性核不育类型进行水稻的轮回选择，并结合分子生物学技术对隐性核不育基因进行早期鉴定，减少工作量。xa0被子植物花药的发育包括花药的分裂与花粉粒的发育。成熟的花药包括表皮、内皮层、中层以及绒毡层四层细胞。花药和花粉壁的正常发育对植物育性非常重要。目前在水稻中报道与花药以及花粉壁发育相关的基因有WDA1、PTC1、OSC6、TDR、UDT1、GAMYB、CYP704B2、DPW、OsRaftin1等。这些基因的突变体在细胞学上表现为花药表皮蜡质层和花粉壁都缺失，或表现为花粉壁缺失，这些突变体最终都表现为雄性不育。ABCxa0(ATPxa0bindingxa0cassette)xa0转移蛋白是广泛存在于动植物中的一个非常大、多样性丰富的基因家族。其主要功能是直接参与大量分子的跨膜运动。在植物中ABC转移蛋白尤其丰富，比如拟南芥和水稻中分别有编码ABC转移蛋白130个和132个，这些转移蛋白分别属于不同的亚家族。其中ABCG亚家族是在水稻和拟南芥中最大的ABCxa0转移蛋白亚家族，该家族成员都是编码半分子量转移蛋白，其必须与另外的半分子量转移蛋白相互作用才能形成一个有功能ABC转移蛋白。在植物中ABC转移蛋白的底物具有很高的多样性，包括铁、脂肪酸、荷尔蒙等（Reaxa0PA.Annualxa0Reviewxa0ofxa0Plantxa0Biology.2007.xa058(1):347-375。Jasinskixa0M等.Biochimxa0Biophysxa0Acta.2003.1465(1-2):79-103）。ABCG亚家族中已有6个家族成员被报道了相关功能。在拟南芥中ABC11/COF1,xa0ABCG12/CER5,xa0ABCG13xa0andxa0ABCG26xa0参与脂肪酸转移。另外两个STAR1和STAR2与水稻耐铝相关，可能是参与铝离子的转移（Huangxa0CF等.xa0Thexa0Plantxa0Cell.2009.21(2):655-667）。但是与育性相关的功能尚未见报道。四川农业大学于1988年发现了一个水稻单隐性核不育材料（该核不育材料在本发明中被称为H2S或H₂S,是指同一核不育材料），显微观察发现在小孢子时期，该不育材料绒毡层未表现明显的降解，而小孢子表现出明显的降解，最终导致成熟时期突变体无花粉；电镜观察发现成熟时期该不育材料花药表皮细胞无角质层以及蜡质层的堆积，以及缺失花粉外壁与乌氏体结构（王玉平，2007年博士论文，四川隐性核不育水稻的遗传研究与育种利用；李园园，2008年硕士论文，水稻雄性不育突变体的细胞学研究及遗传分析）。经过研究将该基因初步定位于第6染色体的W11和W19xa0两个Indelxa0标记之间；u3000专利申请《利用隐性核不育材料进行籼稻轮回选择育种的方法》（申请号为：200910250526.4）中公开了将该单隐性核不育材料在水稻轮回选择育种中的应用，并育成了一些突出优良的品种。ABCG15属于ABC转移蛋白G亚家族成员xa0（Paulxa0J.xa0Verrierxa0等。xa0Trendsxa0inxa0Plantxa0Sciencexa02008.13xa0(14):151-159），经检索，没有发现有关ABCG15在水稻雄性不育方面用途的报道。
发明内容
本发明目的在于提供利用RNAi技术控制水稻育性基因获得水稻不育系的方法。为实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种控制水稻育性的基因，命名为ABCG15，由下述（1）或（2）组成：（1）由SEQxa0IDxa0NO:1xa0所示的核苷酸序列组成；（2）由SEQxa0IDxa0NO:1xa0所示的核苷酸序列经过插入、缺失或替代一个或多个碱基，与SEQxa0IDxa0NO:1xa0所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性且编码与（1）相同功能蛋白质的核苷酸序列组成。编码上述控制水稻育性的基因的蛋白质，是下述（1）或（2）的蛋白质：（1）由SEQxa0IDxa0NO:2所示的氨基酸序列组成；（2）将SEQxa0IDxa0NO:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加且与水稻育性相关的氨基酸序列组成。含有外源上述控制水稻育性基因的表达载体、宿主细胞或植物。所述的载体是指pCambia1300，pCambia1301或pOsact2等。所述的宿主细胞是指农杆菌或大肠杆菌等。所述的植物是指水稻、玉米、小麦、大豆、拟南芥或油菜等。一个水稻单隐性雄性不育基因，由下述（1）或（2）组成：（1）由SEQxa0IDxa0NO:3xa0所示的核苷酸序列组成；（2）由SEQxa0IDxa0NO:3xa0所示的核苷酸序列经过插入、缺失或替代一个或多个碱基，与SEQxa0IDxa0NO:3xa0所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性且编码与（1）相同雄性不育功能的核苷酸序列组成。含有上述水稻单隐性核不育基因的表达载体、宿主细胞或植物。所述的载体是指pCambia1300，pCambia1301或pOsact2等载体。所述的宿主细胞是指农杆菌或大肠杆菌等。所述的植物是指水稻、玉米、小麦，油菜、大豆、短柄草或拟南芥等。利用RNAi技术控制上述水稻育性基因的表达获得水稻不育系的方法，包括如下步骤：（1）PCR扩增，获得用于产生反义RNA的DNA片段（ASABCG15）：以正常可育的水稻品种的cDNA为模板，以ASABCG15-F和ASABCG15-R为引物进行PCR扩增，获得493bp（SEQxa0IDxa0No:16）的PCR扩增产物，命名为ASABCG15；所述的引物为：ASABCG15-F:xa0CGGGGTACCACGGCCATCCTCTACTTCATGG（SEQxa0IDxa0No:4），ASABCG15-R:xa0CCGGAATTCCTACAAGGGCATGAGGCTGATC（SEQxa0IDxa0No:5）；所述的PCR反应体系为：cDNAxa03μL（200ng），dNTP（2mM）5μL，10XPCRxa0缓冲液xa05μL，25mMxa0Mg²⁺xa02μL，引物10μMxa01.5μL；KOD-plus-NEOxa0酶(1U/μL)xa01.5μL；DMSOxa01.5μL；H₂Oxa030.5μL；所述的PCR的反应条件：94℃xa02min；98℃xa010s，68℃xa030s，35个循环；72℃10min，10℃xa01min；（2）构建RNAi干涉载体：回收PCR扩增产物，并将PCR扩增产物与载体PMD20连接，得连接产物；将连接产物转化至宿主细胞，37℃过夜培养；然后挑取单菌至LB液体培养基过夜培养；提取质粒，然后检测阳性质粒，并对质粒中的插入序列进行测序，确认插入序列为ASABCG15序列，得到PMD20-ASABCG15载体；将PMD20-ASABCG15载体和pOsAct2-nos载体同时用KpnⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，将酶切产物回收，连接、转化，构建成pOsAct2-ASABCG15载体；将pOsAct2-ASABCG15xa0载体通过农杆菌转化到EHA105菌株，转化后所得菌株命名为EHA105-pOsAct2-ASABCG15；（2）培育水稻愈伤组织，将EHA105-pOsAct2-ASABCG15通过农杆菌介导转化的方法转化进水稻愈伤组织中，然后利用潮霉素基因对转基因苗进行阳性检测，并且对ABCG15的RNA表达量进行检测，选择表现完全雄性不育、且检测不到ABCG15表达量的植株，即为通过RNAi技术得到的水稻雄性核不育材料。所述的水稻品种可以是日本晴。与现有技术相比，本发明具有的优点和有益效果：xa0本发明利用RNAi技术对该基因进行基因工程改造使其育性丧失，为水稻核不育系培育提供了一个简单、迅速、有效的方法；利用本发明的核不育基因可进行转基因培育新的核不育系；本发明核不育材料可用于在水稻杂交时取代人工去雄，节约劳力，尤其可用于需要进行大量杂交的轮回选择育种，对扩大水稻的种质基础有重要作用。u3000
附图说明
图1.ABCG15基因精细定位示意图。图xa02.RT-PCR检测ABCG15基因突变体cDNA中电泳图谱，其中1野生型带，2为杂合体带，3为突变体带。图xa03.互补片段电泳图谱。图xa04.互补表达载体结构示意图。图xa05.颖花对比照片，其中1为突变体，2为互补植物，3为野生型。图xa06.互补植物的花药染色显微照片。图xa07.RNAi表达载体结构示意图（实心黑框代表ABCG15xa03’端部分序列的反义序列）图xa08.RNAi转基因植株对比照片；其中1为转基因植株中部分结实的植株，2为转基因植株中完全不结实的植株。图xa09.RNAi转基因植株的花药照片。图xa010.RNAi转基因植株的花药照片。图xa011.RNAi转基因植株的花粉粒显微照片。图xa012.RNAi转基因植株的花粉粒显微照片。图13.RNAi转基因植株与野生型日本晴植株中ABCG15定量RT-PCR柱形图；其中编号1-10分别为阳性转基因单株，WT为日本晴。图14.与图13对应的RNAi植株的结实率柱形图；其中编号1-10分别为阳性转基因单株，WT为日本晴。
具体实施方式
下面以具体实施例对本发明作进一步说明，但是不应被理解为对本发明保护范围的限制。实施例1xa0本发明单隐性核不育基因的精细定位（1）采用遗传差异大的两个测序亲本9311和日本晴分别与H₂S杂交，构建定位群体。（2）利用H₂S与9311和日本晴之间具有多态性的SSR引物以及Indel（insertion-deletion）标记，在H₂S×xa09311组合xa0F₂xa0的1200个隐性不育单株中，以及H₂S×日本晴xa0F₂中1320个隐性不育单株中分析了亲本之间具有多态性的标记Indel40520和RM20366与不育基因之间的连锁关系。（3）将控制该雄性不育的基因定位在Indel40520和RM20366之间的45K距离（见图1）。Indel40520标记的引物序列为：Indel40520F：TTGGTCCCACAAATAAGTCATGxa0xa0xa0（SEQxa0IDxa0No:6），Indel40520R：TTGGAGCAACTGAAGCAAGGAAxa0xa0u3000（SEQxa0IDxa0No:7）；该基因被定位在第6染色体50kb的区间内，这个区间共有7个候选基因。这7个基因只有Loc_OS06g40550（http://rice.sinica.edu.tw/rice/）在减数分裂末期高表达，因此该基因为最佳候选基因。实施例2xa0xa0本发明水稻单隐性核不育基因的克隆和鉴定根据实施例1的基因定位结果，将Loc_OS06g40550基因作为候选基因进行测序分析。以H₂S基因组DNA为模板，以CDS40550-F和CDS40550-R为引物进行PCR扩增，所述的测序引物为：xa0CDS40550-F:xa0CACCATGATGGAGATCAGCAGCAATu3000（SEQxa0IDxa0No:8）,CDS40550-R:xa0CTACAAGGGCATGAGGCTGATu3000u3000u3000（SEQxa0IDxa0No:9）；所述的PCR反应体系为：H₂S基因组DNAxa03μL（200ng），dNTP（2mM）5μL，10XPCRxa0缓冲液xa05μL，25mMxa0Mg²⁺xa02μL，引物10μMxa01.5μL；KOD-plus-NEO酶xa0(1U/μL)xa01.5μL；DMSOxa01.5μLxa0(TOYOBO公司提供)；H₂Oxa030.5μL。所述的PCR的反应条件为：94℃xa02min；98℃xa010s，68℃xa01:30min，35个循环；68℃10min，10℃xa01min。回收PCR产物（方法参照Omega回收试剂盒说明书），将回收的PCR产物与D-topo载体连接1小时（Topoxa0连接体系为：目的片段2ng，Saltxa0Solutionxa00.5ul，D-Topo载体xa00.5ul,xa0H₂Oxa0补足3xa0ul），将连接产物转化至大肠杆菌（方法参照：萨姆布鲁克《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年），37℃过夜培养。然后挑取单菌至LB液体培养基过夜培养，再提取质粒用于阳性检测（质粒提取参照天根质粒提取试剂盒说明书）。检测阳性质粒（将质粒在37℃下进行酶切反应4h；酶切反应体系为20μL，10×Kxa0bufferxa02μL，BamHⅠ(宝生物产品)1μL，XbaⅠ(宝生物产品)1μL，质粒xa05μL，水xa011μL）。经电泳检测确定含有目的片段的阳性克隆，然后将阳性质粒送英俊生物技术公司测序。测序结果发现H₂S在Loc_Os06g40550基因组序列的4943bp到4957bp之间缺失了GCCACCCTCCTCxa012bp的核苷酸序列（野生型Loc_Os06g40550基因序列见SEQxa0IDxa0No:1；H₂S中突变基因序列见SEQxa0IDxa0No:3）。RT-PCR检测：跨这12bp缺失序列设计了产物长度为147bp的引物Q11F和Q12R，以野生型（H₂SW）、杂合体（H₂SH）和H₂S突变体cDNA为模板，以Q11F和Q12R为引物进行RT-PCR扩增，检测RNA中是否也有12bpxa0的缺失；所述的引物为：Q11F：CGACGCGGTGCCGCACGTCGTGTu3000xa0xa0（SEQxa0IDxa0No:10），Q12R：AGCTCGCCGGTGCCCTGGCTGGTGu3000xa0（SEQxa0IDxa0No:11）；RT-PCR结果（见图2）突变体带小于野生型带，杂合体则同时出现了野生型和突变体的带，这表明12bp的缺失也存在于RNA中，同时测序结果显示H2S中的cDNA也缺失相同的12bp，说明很有可能Loc_Os06g40550基因中12bp的缺失突变导致了H2S雄性不育。因为Loc_Os06g40550编码的蛋白属于ATPxa0Bindingxa0Cassettexa0(ABC)xa0转运蛋白家族的G亚家族的第15个，因此该基因命名为ABCG15，因此可以推测ABCG15为控制水稻育性的基因。实施例3u3000互补转基因验证试验按照如下方法进行：1xa0互补表达载体的构建：为了验证H₂S雄性不育材料是否为ABCG15中12bp的缺失所导致，进行互补转基因验证实验。互补表达载体的构建方法如下：1.1以正常可育的野生型（H₂SW）植株叶片提取的基因组DNA为模板，以Q51和Q52为引物进行PCR扩增；所述的引物为：xa0xa0Q51:CCGGAATTCTGAATCGTCGTCACCTGCTAAGCCCAAAT（SEQxa0IDxa0No:xa012），Q52:CGGGGTACCGTGTCCCTCCCTACCCAACCTAACCCAAC（SEQxa0IDxa0No:xa013）；其中PCR的反应体系为：基因组DNAxa03μL（200ng），dNTP（2mM）5μL，10xPCRxa0bufferxa05μL，25mMxa0Mg²⁺xa02μL，引物10μMxa01.5μL；KOD-plus-NEO(1U/μL)xa01.5μL；DMSOxa01.5μLxa0(TOYOBO公司提供)；H₂Oxa030.5μL。其中PCR的反应条件为：94℃xa02min；98℃xa010s，74℃xa04min，5个循环；98℃xa010s，72℃xa04min（30s/kb），5个循环；98℃xa010s，70℃xa04min（30s/kb），5个循环；98℃xa010s，68℃xa04min（30s/kb），25个循环；68℃10min。电泳结果（见图3）显示获得含有1500bpxa0启动子序列，ABCG15基因序列以及TGA下游400bp在内的8Kbp片段。1.2xa0xa0回收PCR产物（参照Omega回收试剂盒说明书），与pColumbia1300载体同时用Kpn1和EcoRⅠ进行双酶切16小时（酶切反应体系为：20μL，10×Kxa0bufferxa02μL，Kpn1（宝生物产品)1μL，EcoRⅠ(宝生物产品)1μL，pCambia1300质粒或PCR产物xa05μL，水11μL）；回收酶切产物（参照Omega回收试剂盒说明书进行），将回收的酶切PCR产物与酶切后的载体进行连接：（连接反应体系：酶切后的PCR产物8ul，酶切后的载体2ul，高效连接酶（TOYOBO公司）10ul，共计20ul，连接反应条件：混合后于16℃过夜连接。将连接产物转化至大肠杆菌（转化方法参照：萨姆布鲁克《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年），37℃过夜培养；然后挑取单菌至LB液体培养基过夜培养，然后提取质粒用于阳性检测（质粒提取参照天根质粒提取试剂盒说明书）。1.3xa0检测阳性质粒：将步骤（2）中所得质粒在37℃下用Kpn和EcoRⅠ进行酶切反应4h（酶切反应体系为：20μL，10×Kxa0bufferxa02μL，Kpn（宝生物产品)1μL，EcoRⅠ(宝生物产品)1μL，质粒5μL，xa0H₂Oxa011xa0μL）、将质粒中的插入序列送交英俊生物技术公司进行测序，确认插入序列为ABCG15基因序列，成功构建互补表达载体p13000-ABCG15(见图4)。1.4xa0将p1300-ABCG15互补表达载体转化到农杆菌EHA105菌株，转化后的菌株命名为EHA105-p1300-ABCG15xa0（农杆菌感受态以及转化方法参照：萨姆布鲁克《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年）。2xa0遗传转化试验2.1愈伤组织的诱导：取H2S抽穗到3-4期的幼穗（1-2cm最佳），用75%酒精浸泡消毒40s，然后用无菌水冲洗1次，再用0.1%的升汞浸泡8min，接着用无菌水清洗5次，放置于带滤纸的培养皿中滤干，用镊子将幼穗接种于NMB培养基（其组成成分和比例见表1）上，于28℃光照条件下培养10-15天xa0；10天继代一次，继代2～3次后，挑取生长良好的愈伤组织，把它们接于MS培养基（其组成成分和比例见表1）上，28℃暗培养4d。2.2xa0农杆菌菌株的活化：取步骤1.4中所得的农杆菌EHA105-p1300-ABCG15u300030μL于3xa0mL含有利福平和卡那霉素的YEP液体培养基（其组成成分及其重量比为：酵母提取物1g，蛋白胨1g，氯化钠0.5g,水xa0100ml），在200rpm、28℃下振荡培养14h；再取其中1mL于含有利福平和卡那霉素的50mL的YEP液体培养基中，28℃振荡培养4h；得活化的农杆菌EHA105-p1300-ABCG15菌液。2.3xa0共培养转化：将步骤2.2中活化的农杆菌EHA105-p1300-ABCG15菌液在5000xa0rpm下离心收集菌体，用添加有100μM/L乙酰丁香酮的液体共培养基（组成成分及其比例见表2）30mL重悬菌体成均匀的菌液，然后将预先挑好的愈伤组织浸在菌液中20min，吸去多余的菌液，平铺于固体共培养基（组成成分及其比例见表2）上，28℃暗培养2d。2.4xa0愈伤脱菌与愈伤抗性筛选：将共培养的愈伤组织用无菌水冲洗3-5次至水澄清，然后用含头孢霉素(500mg/L)的无菌水振荡30min至澄清，再将愈伤组织用无菌滤纸或吸水纸彻底吸干，然后接种于筛选培养基（组成成分及其比例见表2）上培养3周左右。2.5分化与生根u3000将上述新长出的抗性愈伤组织接种到分化培养基（组成成分及其比例见表2）上进行在光照条件下培养1-2个月，然后将长出的3cm左右高的幼苗转到生根培养基（组成成分及其比例见表2）上培养，当苗长至约10xa0cm时，炼苗后移栽于大田，以潮霉素引物（HPTF:TACACAGGCCxa0ATCGGTCCAGA；HPTR:xa0TAGGAGGGCGTGGATATGTC）检测阳性植株；PCR反应体系为：转基因植株的基因组DNAxa02xa0ul，10×bufferxa02xa0ul，dNTP(2.5mM)xa02xa0ul，潮霉素hpt引物xa02xa0ul，H₂Oxa011.8xa0ul，Taq酶（5U/ul）xa00.2xa0ul。PCR反应条件：94℃xa05min；94℃xa030s，58℃xa030s，72℃xa030s，35个循环；72℃xa010min；20℃xa0xa02min。结果检测出15株阳性植株，转基因阳性植株的形态，颖花和花药（见图5（2））以及花粉粒染色结果（见图6）都与野生型H₂SW相近，且转基因植株都表现为可育。该结果进一步证明了ABCG15基因12bp的缺失导致了该雄性不育突变体的表型，同时也表明ABCG15是参与调控水稻花药以及花粉壁发育的重要基因。实施例5xa0通过抑制ABCG15基因的表达来创造水稻核不育材料试验1．构建RNAi干涉载体根据水稻ABCG15xa0cDNA序列，对ABCG15xa03’端设计一对反义链引物：ASABCG15-F:xa0CGGGGTACCACGGCCATCCTCTACTTCATGG，（SEQxa0IDxa0No:4）ASABCG15-R:xa0CCGGAATTCCTACAAGGGCATGAGGCTGATC；（SEQxa0IDxa0No:5）以水稻品种日本晴的cDNA为模板进行PCR扩增，获得长度为493bp的序列（SEQxa0IDxa0No:16），命名为ASABCG15；其中PCR的反应体系为：cDNAxa03μL（200ng），dNTP（2mM）5μL，10XPCRxa0缓冲液xa05μL，25mMxa0Mg²⁺xa02μL，引物10μMxa01.5μL；KOD-plus-NEO酶xa0(1U/μL)xa01.5μL；DMSOxa01.5μLxa0(TOYOBO公司)；H₂Oxa030.5μL。PCR的反应条件为：94℃xa02min；98℃xa010s，68℃xa030s，35个循环；72℃10min，10℃xa01min；回收PCR产物（参照Omega回收试剂盒说明书），将回收的PCR产物连接至PMD20T载体（宝生物公司提供）（反应体系：回收的PCR产物4xa0ul,PMDxa020Txa0载体xa01xa0ul,反应条件：16℃，过夜连接）。将连接产物转化至大肠杆菌（方法参照：萨姆布鲁克《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年），37℃过夜培养。然后挑取单菌至LB液体培养基（组成成分及其重量比为：酵母提取物xa00.5g，蛋白胨1g，氯化钠1g，H₂Oxa0100ml，pH7）过夜培养后提取质粒用于阳性检测（质粒提取参照天根质粒提取试剂盒说明书）。然后检测阳性质粒（将质粒在37℃下进行酶切反应4h（酶切反应体系为20μL，10×Kxa0bufferxa02μL，Kpn（宝生物产品)1μL，EcoRⅠ(宝生物产品)1μL，质粒5μL，xa0H₂Oxa011xa0μL））、对质粒中的插入序列送交英俊生物技术公司进行测序，确认插入序列为ASABCG15序列，得到PMD20-ASABCG15载体；然后将PMD20-ASABCG15载体和pOsAct2-nos载体（Hexa0Chengkun等.xa0Plantxa0Biotechnologyxa0Journal.2009.7，227-239）同时用KpnⅠ和EcoRⅠ进行双酶切（酶切体系为：20μL，10×Kxa0bufferxa02μL，KpnⅠxa0(宝生物产品)1μL，EcoRⅠ(宝生物产品)1μL，质粒xa05μL，水xa011μL），将酶切产物回收，连接、转化、质粒提取以及质粒阳性检测最后构建成pOsAct2-ASABCG15载体（见图7）（回收、连接、转化、质粒提取参照上述步骤）。然后将构建的pOsAct2-ASABCG15载体通过农杆菌转化到EHA105菌株，转化后的阳性菌株命名为EHA105-pOsAct2-ASABCG15。2xa0遗传转化试验2.1水稻愈伤组织的培养：取日本晴种子，脱壳后，用75%酒精消毒2min，然后用无菌水冲洗1次，再用0.1%的升汞浸泡18min，接着用无菌水清洗几次，放置于带滤纸的培养皿中滤干，接种于NMB培养基（组成成分及其比例见表1）上，于30℃光培养10-15天，就会看见有较小的愈伤出现。继代1-2次后，挑取生长良好的愈伤组织，把它们接于NMB预培养基上，28℃暗培养4d。2.2xa0遗传转化：将EHA105-pOsAct2-ASABCG15转化至步骤2.1所得的日本晴的愈伤组织中（农杆菌介导的转化方法同实施例4中第2.2-2.5部分）,得转基因苗。3试验结果：3.1xa0转基因植株检测与育性观察利用潮霉素基因对转基因苗进行PCR阳性检测，(xa0PCR反应体系：转基因植株的基因组DNAxa02xa0ul，10×bufferxa02xa0ul，dNTP(2.5mM)xa02xa0ul，潮霉素hpt引物xa02xa0ul（引物同实施例4中的潮霉素引物），H₂Oxa011.8xa0ul，Taq酶（5U/ul）xa00.2xa0ul；反应条件：94℃xa05min；94℃xa030s，58℃xa030s，72℃xa030s，35个循环；72℃xa010min；20℃xa0xa02min)，得到50株阳性转基因苗。其中表现为育性小于30%的共33株，占总数的66%；表现为完全雄性不育的有6株。图8中编号为1,2的植株分别代表转基因植株中部分结实（1）和完全不结实（2）的植株，图9和图10分别是转基因植株中部分结实植株的颖花（饱满呈黄色）和完全不结实植株的颖花（瘦小呈白色）。图11和图12分别代表转基因植株中部分结实植株花药的染色结果（花粉正常）和完全不结实植株花药的染色结果（无花粉粒）。3.2转基因植株中ABCG15的表达量检测试验为了检测低育性植株是否是由于抑制ABCG15表达量所导致的，选取部分转基因阳性单株利用RT-qPCR检测其ABCG15的表达量。（1）.xa0实验材料：野生型小孢子时期颖花和10个转基因单株小孢子时期的颖花（2）.试验方法：水稻RNA提取(参照QIGEN植物小量RNA提取试剂盒说明书(Code.74904)).xa0cDNA第一链合成使用ReverTraxa0Ace–α-(TOYOB,Code.FSK-100)xa0试剂盒（程序参照试剂盒说明书）。体系为12ul：随机引物(25pmol/ul)xa01ul，Oligo(dT)xa0xa0xa0xa0(10pmol/ul)xa01ul，总RNAxa0600ng，不含RNA酶的xa0H₂O补齐12ul。将反转录出的cDNA母液稀6倍，然后进行荧光定量PCR，所使用的试剂盒为：SsoFastxa0EvaGreenxa0supermixxa0(Bio-Rad)。定量PCR体系为10ul：SsoFastxa0EvaGreenxa0supermixxa05ul，引物(4uM)xa01ul（F:xa0TTGGTCCCACAAATAAGTCATGxa0(SEQxa0IDxa0No:15xa0)；xa0R：TTGGAGCAACTGAAGCAAGGAAxa0(SEQxa0IDxa0No:16)），cDNAxa01ul，不含RNA酶的H₂Oxa03ul。荧光定量PCR程序：95℃xa030sec，95℃xa05sec；58℃xa05secxa0（39循环）。荧光定量PCR仪为Bio-Radxa0C1000,利用CFXxa0Managerxa0Softwarexa0versexa01.6数据分析软件分析表达量。结果（见图13）大部分转基因植株中的ABCG15表达量降低。对应的结实率观测结果（图14）显示ABCG15表达量降低的植株其结实率也降低，反之结实率没有明显变化(图14-第2株)，ABCG15的表达量也没有明显变化。本试验表明这些阳性的转基因单株结实率降低是由于ABCG15的表达量降低所引起的。由此可见，可以通过抑制水稻野生型ABCG15基因的表达，达到降低水稻育性或创造完全的雄性不育单株，同时本试验也进一步证明了ABCG15为控制水稻育性的基因。附：xa0培养基的配方：本实验中愈伤的诱导、继代、共培养及筛选所采用的基本培养基为NBM培养基；分化和生根所用的培养基其基本培养基为MS培养基。表1u3000本发明实施例中所用的基本培养基MS培养基和NMB培养基

MS培养基（1L）


NMB培养基（1L）
MS大量（20x）
50ml
N6（20x）
50ml
MSⅠ（100x）
10ml
MSⅠ（100x）
10ml
MSⅡ（1000x）
1ml
MSⅡ（1000x）
1ml
铁盐（200x）
5ml
铁盐（200x）
5ml
烟酸（1000x）
0.5ml
烟酸（1000x）
1ml
VB6（1mg/ml）
0.5ml
VB6（1mg/ml）
1ml
VB1（10mg/ml）
40μl
VB1（10mg/ml）
1ml
甘氨酸（2mg/ml）
1ml
2,4-D（2mg/ml）
1ml
2,4-D（2mg/ml）
1ml
肌醇
0.1g
KT(0.5mg/l)
500μl
谷氨酰胺
0.25g
肌醇
0.1g
脯氨酸
0.5g
谷氨酰胺
0.25g
酸水解酪蛋白
0.3g
脯氨酸
0.5g
蔗糖
30g
酸水解酪蛋白
0.3g
琼脂粉
7.2g
蔗糖
30g
pH
5.8
植物凝胶
3.0g




pH
5.8




表２u3000u3000转化实验中用到的其他培养基及其组成成分ntent="drawing" img-format="jpg" inline="yes" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="482"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="485"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="461"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="445"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="484"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="485"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="498"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="483"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="484"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="599"/>